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上海恒遠(yuǎn)技術(shù)巡回講座第二站——南京大學(xué)

閱讀次數(shù):1007   發(fā)布時間:2016/7/25 9:57:23

        上海恒遠(yuǎn)技術(shù)巡回講座第二站圓滿落幕!上月我司的站技術(shù)講座在上海交通大學(xué)成功舉辦,其后反響很不錯;昨日,我司到訪南京大學(xué)并舉辦了技術(shù)講座。此次講座分為兩個部分,即《有關(guān)elisa試劑盒的注意事項》、《ELISA試劑盒常見問題問答》。
《有關(guān)ELISA試劑盒的注意事項》: 
1.
保存:試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染,否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。 
2.
酶標(biāo)板:剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),此為正常現(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成
任何影響。暫時不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋,按推薦溫度存放! 
3.
加樣:加樣或加試劑時,個孔與*后一個孔的加樣時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的
預(yù)溫育"時間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時間控制在
10
分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。 
4.
溫育:為防止樣品蒸發(fā),實驗時必須給酶標(biāo)板覆膜;洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,避免酶標(biāo)
板處于干燥狀態(tài);嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。 
5.
洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸
水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 
6.
試劑配制:Concentrated Biotinylated Detection AbConcentrated HRP Conjugate體積較
小,運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用前1000轉(zhuǎn)/分離心1min,以使附著管壁或瓶
蓋的液體沉積到管底。取用前,請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗
體工作液、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請
精確配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取Concentrated Biotinylated Detection 
Ab
時,一次不要小于10μL),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋
過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次
用量分裝,將其放在-20-80貯存。避免反復(fù)凍融。 
7.
顯色時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如每隔5分鐘),如梯度已很
明顯,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 
8.
底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。 
9.
混勻:充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要,使用微量振蕩器(使用頻率),如無微量
振蕩器,可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。 
10.
安全:試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品
時,請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。 
11.
不同批號的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應(yīng)終止液除外) 
12.
試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用,嚴(yán)禁混用,否則將影響試驗結(jié)果! 
《ELISA試劑盒常見問題問答》:

(1)問:小鼠乙酰膽堿Elisa試劑盒后期數(shù)據(jù)處理中空白的OD值有什么作用?

     答:可以將標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值同時減去空白的值進行計算,或者都不減,保持同一水平就行。 

(2)問:那我們算出來的ACH含量為什么出現(xiàn)負(fù)值?

     答:說明個別樣本的濃度很低,當(dāng)濃度接近第6個點的時候,直線方程就有可能計算出負(fù)值。

(3)問:小鼠乙酰膽堿ELISA試劑盒,組織標(biāo)本 切割標(biāo)本后能用生理鹽水稀釋嗎?還有稀釋的倍數(shù)是多少?

     答:生理鹽水也可以,加入量1:3。

(4)問:我想問一下,標(biāo)準(zhǔn)品濃度與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值之間是不是線性回歸?檢測出來的吸光度值很低一般都存在哪些原因?大部分在0.08左右 ?(大鼠5羥色胺(5-HT)Elisa試劑盒)

     答:是線性回歸。檢測出來的值比較低 ,樣本、稀釋、操作等,原因很多,但只要在可操作范圍就行 。 

(5)問:做出來的結(jié)果:標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度呈線性回歸,但是樣品的吸光度都和本體吸光度值接近,正常未予干預(yù)的大鼠血漿都基本沒有5-HT 表達(dá),這是什么原因?(大鼠5羥色胺(5-HT)Elisa試劑盒)

     答:樣本、稀釋、室控和機器操作等,原因都可能造成吸光度都和本體吸光度值接近,好像熒光法里面有種試劑盒可以檢測滴度。

(6)問:Elisa試劑盒的使用的方法是什么啊?

     答:采用雙抗夾心法 (目前暫行)

(7)問:一個孔需要多少量的血清?

     答:一個孔上樣量10-50微升。

(8)問:未處理的樣本我需要郵寄多少的量?

     答:每個孔需要100ul

(9)問:樣本怎么保存?

     答:當(dāng)天要用的樣本保存4℃隔天樣本-20℃(近期一個月左右要用的樣本),長期保存樣本-70℃(一年或者更長時間多久都可以用),避免反復(fù)凍融。

(10)問:EP管是什么管?

      答:離心管。

(11)問:收集血清的時候用什么管?

      答:普通離心管即可。

(12)問:96t可以檢測多少個樣本?48t可以檢測多少個樣本?

      答:96t標(biāo)準(zhǔn)的可以檢測85個樣本,其他有10個標(biāo)準(zhǔn)品孔,1個空白對照。96t單孔可以檢測90個樣,7個標(biāo)準(zhǔn)品控 1個空白對照。48t標(biāo)準(zhǔn)的可以檢測37個樣本,其他有10個標(biāo)準(zhǔn)品孔,1個空白對照。48t單孔可以檢測40個樣本,其他有7個標(biāo)準(zhǔn)品孔,1個空白對照。

(13)問:標(biāo)準(zhǔn)的檢測85個樣本的和單孔相比, 有什么好的地方嗎?

      答:標(biāo)準(zhǔn)的檢測又叫復(fù)孔檢測,標(biāo)準(zhǔn)的檢驗重復(fù)性測的結(jié)果好,所以大家都叫復(fù)孔是標(biāo)準(zhǔn)的檢測。

(14)問: 酶標(biāo)板分次使用 剩下的建議怎么保持 ?

      答:要是真的用不完或標(biāo)本不多的情況下。做點處理后:板條和板架都是可拆卸的,可以再用之,前拆下4條放置錫箔袋或其他無污染的袋子,放到冰箱 2-8度保存。

(15)問:酶標(biāo)包被版是酶標(biāo)板嗎?

      答:是的。

(16)問:請問植物茉莉酸和水楊酸檢測的試劑盒,我們提取擬南芥的,一般取樣量是多少?

      答:1-3g。

(17)問:大鼠骨特異性堿性磷酸酶B(ALP-B)ELISA,大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5B),我發(fā)現(xiàn)試劑盒里缺少標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,沒有它我的實驗無法進行,盒子里面有特殊稀釋液是用來稀釋樣品的,但都沒有標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,我的樣品已超出檢測限,所以需要稀釋標(biāo)準(zhǔn)品才行嗎?

     答:特殊稀釋液是用來稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的,特殊稀釋液一般情況不用當(dāng)樣本濃度特別高是先用特殊稀釋液稀釋,標(biāo)準(zhǔn)品需要再稀釋就也要用特殊稀釋液。

(18)問:測出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線值前面幾盒都是0.98 才正常,后面怎么變成0.93了?

      答:某個點偏離大可以去掉,保留5個點

(19)問:是不是空白對照就是什么都不加?

      答:不加樣本,不加樣本稀釋液,不加酶標(biāo)試劑 其他都可以加。

(20)問:樣本稀釋液是配好的嗎?

      答:樣本稀釋液是配好的

(21)問:樣本稀釋液可以用來直接稀釋血清嗎?

      答:可以,直接加40ul就可以。

(22)問:檢測的時候需要在操凈臺中操作嗎,還是在外面操作就可以了?

      答:要求不是很嚴(yán)格,根據(jù)自己實驗室的設(shè)備而定,都可以。

(23)問:人和肽素(copeptin)Elisa,洗滌液是濃縮的,是一次配好,還是現(xiàn)配現(xiàn)用?

      答:濃縮的,現(xiàn)配現(xiàn)用。

(24)問:Elisa方法的不測人血小板第四因子里IgG抗體的滴度嗎?

      答:Elisa不測滴度的,熒光法可以測。

(25)問:酶標(biāo)板不平,影響結(jié)果嗎?

      答:不影響結(jié)果的。

(26)問:小鼠TNF-α ELISA 我的標(biāo)本是細(xì)胞,我想要測的結(jié)果:抑制TNF的產(chǎn)生  空白組、模型組、藥物組,藥物組要成梯度抑制TNF的產(chǎn)生、請問Elisa方法的可以測嗎?

      答:細(xì)胞可以測 但要分組,得到相應(yīng)的梯度值,計算結(jié)果。自己需要多查閱文獻 。

(27)問:人睪酮(T)Elisa,人雌三醇(E3)Elisa,是用什么酶標(biāo)記的?

      答:辣根酶標(biāo)記的  標(biāo)本里不能加疊氮化鈉

(28)問:我測植物水楊酸,標(biāo)本是煙草葉片怎么處理的?那上清液檢測SA時,還需要用甲醇抽提嗎?

      答:稱取煙葉500mg,研磨成粉末狀,加入5ml濃度為0.01mol,PH值為7.4的PBS溶液,充分勻漿,離心取上清液(3000-4000轉(zhuǎn),15分鐘左右),分裝保存,一般需要長期保存需放在-80度,或者液氮中,備用,不用加甲醇。

(29)問:沒有做出標(biāo)準(zhǔn)曲線來,你知道什么原因嗎?

      答:操作肯定有問題,做之前把標(biāo)準(zhǔn)品搖勻下。

(30)問:買同一個指標(biāo)的幾個盒子,用不用都做標(biāo)準(zhǔn)曲線?

      答:如果同一個指標(biāo)買了3盒,建議每盒都做個標(biāo)曲。同一個盒子 ,即使分幾次用,做一個標(biāo)曲也行了,因為數(shù)值不會偏差太大,差不多。

(31)問:那個特殊稀釋液是做什么的?

      答:一般情況都不要用的,他的的用途就是稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。但是,現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)稀釋好了,所以不需要用了。如果你需要更多的標(biāo)準(zhǔn)品的話,可以用他來稀釋。

(32)問:你們的試劑盒什么成分是進口的 什么事國產(chǎn)的?板子酶標(biāo)和抗體是國產(chǎn)的還是進口的?

      答:抗體、酶標(biāo)試劑、酶標(biāo)板都是進口的、其他試劑是國產(chǎn) 嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作完成 呵呵 

(33)問:比如說我偶然發(fā)現(xiàn)只加樣本稀釋液的也出現(xiàn)淺黃色,這怎么解釋呢?

      答:可能的原因是:洗板時有交叉感染。樣本稀釋液中本身有本底的一個較小的讀數(shù)。也是ELISA的一個局限性,免疫的很多反應(yīng)稀釋液 洗滌液發(fā)揮了很重要的作用,不加的話效果不明顯,但是加了以后有些成分可能有一部分的干擾作用,可以比較不同的廠家的盒子 都存在這些局限性的,但不影響*終的結(jié)果,ELISA嚴(yán)格的說就是一個半定量的方法。

(34)問:那標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)跳孔是怎么回事?

      答:你完全可以拿同樣的標(biāo)準(zhǔn)品再重新做一次 ,做之前搖勻一下,肯定可以做好 。那是操作問題了 ,你可以再做一次的,之前也有客戶出現(xiàn)過類似的問題,學(xué)生做了2次都沒做好,后來老師自己做,就是搖勻了一下,其他操作都一樣,標(biāo)準(zhǔn)曲線做的很完美。

(35)問:建議標(biāo)準(zhǔn)做復(fù)嗎?

      答:標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔是的

(36)問:血清和腸道粘膜勻漿上清,可以用一個盒子嗎?

      答:可以!

(37)問:36個樣品,定96T的,可以測一個重復(fù)吧

      答:可以

(38)問:不同盒子里的孔下次能不能用?

      答:一個盒子有96孔和48的 要是真的用不完或標(biāo)本不多的情況下,做點處理后在存放。

(39)問:什么叫點處理?

      答:板條和板架都是可拆卸的,可以再用之前拆下4條放置錫箔袋或其他無污染的袋子,放到冰箱 2-8度保存。

(40)問:不同批的試劑能不能用?

      答:同樣的盒子不同的批號或是同一個批號,也是不建議混用的。同樣的盒子,分兩次的結(jié)果應(yīng)該是不一樣的,但數(shù)據(jù)部應(yīng)相差太大,應(yīng)在可控制或接受范圍。

(41)問:為什么不建議混用?

      答:不同批號的不可以混用 原因很簡單若不同批號的混用的話 可能得出的結(jié)果不是您想要的 數(shù)據(jù)可能偏差較大

(42)問:測細(xì)胞內(nèi)的蛋白的話怎樣處理樣本 ?

      答:ELISA實驗前需對標(biāo)本進行處理將目的蛋白釋放出來,其他按常規(guī)方法處理即可。

(43)問:代測可以直接接受沒有處理好的樣品嗎?

      答:可以

(44)問:每個肌肉和肝臟樣本,*少需要多少克?

      答:1克就可以了。

(45)問:96T的一次用不完,40天以后再用,如何存放?

      答:標(biāo)準(zhǔn)品放-20度 ,其他放4度,并且板條要密封好。

(46)問:標(biāo)曲做兩個重復(fù)少不少?

      答:不少。

(47)問:試劑盒不同批次會對實驗結(jié)果有影響嗎?

      答:有一定的影響,但是影響不是很大。

(48)問:能不能直接用軟件分析數(shù)據(jù)呢?

      答:可以,用EXCEL或者用SPSS等統(tǒng)計軟件。

(49)問:是不是空白就是什么都不加嗎?

      答:空白不加樣本,不加樣本稀釋液 ,不加酶標(biāo)試劑,其他都可以加。

(50)問:你們這個試劑盒要多少上樣量?

      答:上樣量沒有什么限制, 每個孔的上樣量是10ul。

(51)問:我兩個空白孔一個啥都不加,一個加了后面的A液,B液還有終止液, 請問用哪一個?

      答:用加了A液,B液還有終止液的那個更加準(zhǔn)確,因為樣本都加過這些,可以排除相應(yīng)的干擾。

(52)問:離心完以后用什么管子保存?

      答:離心完用EP管保存就可以。

(53)問:收集病人血液標(biāo)本的時候用什么管?

      答:用普通的離心管收集就可以

(54)問:抗體和底物都是進口的吧?

      答:是的,底物就是TMB 進口的。

(55)問:測的是不同的物質(zhì)為什么測的波長一樣呢?

      答:ELISA的波長全是450, 這就是ELISA,不一樣的話,那就是比色法了,不是ELISA。組織勻漿后就可以檢測。

(56)問:說明書寫要7個標(biāo)準(zhǔn)品是做什么用?

      答:7個標(biāo)準(zhǔn)品,只要6個,第七個是空白對照 。 

(57)問:抗凝劑可以用EDTA嗎?或者加什么做為抗凝劑?

      答:可以,肝素或者EDTA。

(58)問:Elisa代測結(jié)果表格每組表達(dá)什么?

      答:S1-S5 代表 標(biāo)準(zhǔn)品個表格是吸光度 第二個是對應(yīng)表 第三個是數(shù)據(jù)處理(是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品那個線性關(guān)系出來的)第四個表*終結(jié)果是都乘以5得到的問:為什么×5?答:因為我們做的時候是10ul樣本+40ul樣本稀釋液做的 問:那個U是代表什么?答:U是調(diào)零的,什么都不加。 

(59)問:為什么檢測結(jié)果*終結(jié)果單位表達(dá)不一樣?

      答:ng/ml是質(zhì)量單位, pmol/L是濃度單位,一般是沒法換算的,在采購試劑盒時請用戶說明單位1ng/ml = 1000pg/ml。
    兩大主題演講完后,臺下各位科研者以及實驗新手都踴躍提問,積極互動,上海恒遠(yuǎn)的技術(shù)巡回講座第二站圓滿落幕!我司獲得BIM品牌ELISA試劑盒專業(yè)代理權(quán),歡迎來電咨詢哦!
                    
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